ELISA实验原理详解

1、 null

2、 ELISA实验利用酶与抗体或抗抗体通过共价键结合，既保持抗体的免疫特性，又不影响酶的生物活性。

3、 酶标记的抗体能特异性结合固相载体上吸附的抗原或抗体，加入底物溶液后，酶催化反应使无色还原型供氢体转化为有色氧化型，从而产生明显的颜色变化。

4、 通过底物的颜色变化可判断是否存在免疫反应，颜色深浅与样本中抗体或抗原的含量成正比。利用ELISA检测仪对显色程度进行定量分析，将酶促反应的高敏感性与抗原抗体结合的特异性有效融合，从而使ELISA技术兼具高度特异性和灵敏性，成为一种可靠的检测手段。

5、 ELISA实验流程与关键操作要点

6、 选用合适固相载体

7、 聚苯乙烯能有效吸附蛋白质，固定后的抗体或抗原仍保持原有的免疫活性。

8、 聚氯乙烯吸附蛋白质能力强于聚苯乙烯，但其空白值相对稍高。

9、 优质ELISA板需具备强吸附性、低空白值、高孔底透明度，且板间及孔间性能一致。

10、 包裹覆盖

11、 选用符合ELISA标准的微孔板。

12、 选用适用于ELISA的抗体，按推荐浓度稀释或优化最佳工作浓度。

13、 包被缓冲液可选用pH9.6的碳酸盐缓冲液或pH7.2的磷酸盐缓冲液。

14、 在2-8℃下过夜或37℃室温下包被2小时。

15、 包被浓度因载体与包被物特性差异而变化较大，通常范围在每毫升10至20微克之间。

16、 封闭空间

17、 包被后需立即进行封闭，以阻断非特异性结合位点。

18、 选用优质封闭剂，如细胞培养级BSA或Tween，提升实验效果。

19、 加样后孵育

20、 加样时应将试剂加至ELISA板孔底部，避免接触孔壁上部，防止溅出和产生气泡。

21、 孵育时间和温度请参照试剂盒说明书。条件允许时，加样孵育建议使用震荡仪，推荐轨道直径3毫米，转速控制在每分钟500±50转。

22、 严格按照说明书要求确定抗体和酶标物的稀释比例、孵育温度及时间。

23、 洗板是ELISA实验的关键步骤，确保反应的特异性与准确性。

24、 封板膜需每次更换，严禁重复使用，避免交叉污染。

25、 显色反应与终止步骤

26、 使用前须检查，确保底物加入96孔板前呈无色透明状态。

27、 显色底物应现配现用，防止污染。

28、 孵育时间需根据实验条件自行优化，可参照标准曲线最高浓度孔的颜色变化，当蓝色明显显现时即为适宜。