ELISA标准曲线绘制技巧

ELISA实验完成后，可获得标准品和待测样本的OD值。由于标准品浓度已知，可通过其OD值与对应浓度绘制标准曲线，以OD值为横坐标、浓度为纵坐标，并拟合出回归公式。随后将样本的OD值代入该公式，即可计算出对应的浓度值，从而实现对样本中目标物质浓度的定量分析。

1、 将酶标仪测得的标准品OD值与对应浓度数据整理后，准确录入Excel表格中。

2、 用鼠标拖选所需数据区域，点击图表向导，选择XY散点图类型完成创建。

3、 选择散点图类型

4、 选择图表类型中的第一个无连线散点图，所示。

5、 点击下一步后进入所示界面，若输入为本例的横向列表则无需修改，否则需相应调整。

6、 纵向列表应选择列选项。

7、 在进行ELISA标准曲线拟合并计算样本浓度时，由于样本的OD值已知，应将其作为自变量X。从图中可见，横轴X代表OD值，纵轴Y对应标准品浓度，这种坐标设置恰好符合我们通过OD值推算浓度的需求。

8、 当需手动设定X值时，可点击系列进行修改，具体操作所示。

9、 可点击X值和Y值文本框右侧的小图标，实现横纵坐标互换，操作后效果即刻呈现。

10、 下图：

11、 所示，出现图形后，用鼠标拖动选择正确数据区域，调整X轴或Y轴。

12、 调整完毕后点击下一步，进入图标选择界面，所示。

13、 单击下一步，在弹出窗口中选择完成，即可生成包含标准值的完整散点图，效果所示。

14、 完成散点图后，可能会疑惑曲线的位置。操作非常简单：先点击图中标准值的数据点（确保选中），再单击鼠标右键，选择添加趋势线。随后会弹出趋势线类型对话框，提供线性、对数、多项式等多种拟合方式供选择，根据需要进行设置即可。

15、 在进行选择前，首先对上图进行直观观察。若发现各数据点大致能连成一条直线或接近直线的形态，则应选用线性拟合方式，表示最终生成的趋势线为一条直线，其对应的方程形式为 y = ax + b。然而，在常规的ELISA实验中，标准品的各个数据点通常难以完全呈现理想的线性关系，即无法形成一条完美的直线。此时，更适合采用多项式拟合方法。在选择多项式时，还需设定阶数，即确定方程中变量的最高次数。一般情况下，推荐选择2阶，此时拟合出的曲线方程为 y = ax? + bx + c。完成设置后，系统将弹出相应的结果窗口。

16、 此时，标准曲线即趋势线已清晰呈现。为后续通过样本的OD值推算浓度，需显示对应公式。操作时，先用鼠标点击选中该曲线，确认其被完全选中（曲线上出现多个小点标记）。随后单击右键，在弹出的菜单中选择设置趋势线格式。在打开的窗口中切换至选项标签页，勾选显示公式和显示R平方值，此时图表上将同步显示出拟合公式及相关系数R?，便于后续计算与分析。

17、 将样本的OD值代入前述方程，即可计算出相应的浓度。通常ELISA标准曲线的相关系数需大于0.99，本例中达到0.9999，表明曲线拟合度极佳，由此得出的样本浓度结果具有高度可信性，能够准确反映实际浓度水平，为后续分析提供了可靠的数据支持。