生物素标记抗体/蛋白方法

生物素是一种分子量仅为244.31道尔顿的小分子化合物，经化学活化后可高效偶联蛋白质、抗体等生物大分子，且基本不干扰其天然生物活性。它与亲和素（或链霉亲和素）具有极高的特异性亲和力，形成稳定复合物，并借助多级结合效应显著增强检测信号。因此，该技术被广泛用于微量抗原或抗体的定性、定量分析以及组织或细胞水平的精确定位研究。

1、 请认真阅读产品说明书。

2、 计算所需氨基反应性生物素（NH?-Reactive Biotin）的用量。

3、 请提前20分钟将试剂盒从冰箱取出，置于室温下平衡；未使用的氨基反应性生物素仍需冷藏保存。

4、 将30微升DMF加入NH?-反应性生物素粉末瓶中，室温静置10分钟使其完全溶解，所得溶液浓度为10毫摩尔每升。

5、 取1毫克待标记抗体置于过滤离心管中，加入适量标记缓冲液，调整终浓度至2毫克/毫升。随后在12,000倍重力下离心10分钟。需注意：该过滤离心管最大容积为0.5毫升；若初始抗体浓度偏低，可先进行一次超滤浓缩，再按上述步骤操作。整个过程应确保溶液总体积不超过管体上限，以保障离心效果与抗体回收率。

6、 向上述过滤管中加入13.3微升氨基反应型生物素（NH?-Reactive Biotin）及适量标记缓冲液，调整总体积至0.5毫升，轻柔吹打混匀。随后将滤管置于37℃恒温箱中，避光孵育30分钟。孵育结束后，以12,000倍重力离心10分钟，完成标记反应与纯化步骤。

7、 向上述过滤管中加入适量标记缓冲液，调整终体积至0.5 mL，轻柔吹打混匀后，以12,000 × g 离心10分钟。

8、 重复操作3一次

9、 向过滤管中加入0.2毫升标记缓冲液，轻柔吹打混匀；随后将滤芯倒置放入另一离心管，于6000×g条件下离心10分钟。

10、 离心管中的上清液即为生物素标记的抗体。